Amelogeneza și MIH- rolul MMP20 și KLK4

Rezumat

Formarea smalțului este un proces înalt coordonat. Matricea proteică a smalțului, secretată de ameloblaste, conține trei proteine principale: amelogenina, enamelina și ameloblastina. Aceste proteine sunt specifice smalțului și sunt degradate de proteinaze specifice, MMP20 și KLK4. La oameni, mutațiile care apar la genele care codifică proteinazele smalțului pot determina grade variabile de hipomineralizare. La molarii permanenți cu MIH conținutul mineral este foarte scăzut și conținutul proteic poate ajunge la 30-40% din volum. Pentru a înțelege aspectele MIH, trebuie să analizăm funcția MMP20 și a KLK4 în timpul primilor doi ani de viață.

Amelogeneza

Smalțul dentar este cel mai dur țesut din organismul uman și, deși la început este un țesut bogat în proteine, în momentul erupției dintelui în cavitatea orală doar 1% din greutatea sa este reprezentată de proteine. Este compus din 96% carbonat apatită, 3% apăși 1% proteine. Deși materia organicăeste o componentă minoră a smalțului matur, ea joacă un rol foarte important în obținerea durității mecanice a acestui țesut[1]. Formarea smalțului (amelogeneza) poate fi descrisă prin patru stadii definite: presecretor, secretor, de tranzițieși maturare. Stadiile sunt definite de morfologia ameloblastelor.Ameloblastele reprezintăun strat unic de celule care acoperă smalțul în curs de formare și este responsabil pentru compoziția smalțului. Ameloblastele sunt responsabile pentru secretarea proteinelor și a proteinazelor matricei smalțului, inducând formarea unor benzi minerale și organizându-le în tipar prismatic și interprismatic.Stadiul presecretor: Înainte de mineralizare,odontoblastele depun predentina la viitoarea joncțiune smalț-dentină (JSD)[2].Predentina este compusăîn principal din colagen, dar conține de asemenea și proteine necolagenice. Predentina este prima care se mineralizează[3].După mineralizarea inițială a dentinei,preameloblastele care se diferențiază trimit niște prelungiri citoplasmatice prin membrana bazalăpe care o distrug, și apoi ameloblastele încep să secrete proteinele matricei smalțului care inițiază rapid mineralizarea [4]. Stadiul secretor: În acest stadiu, preameloblastele se transformăîn ameloblasteși secretă proteinele matricei smalțului și primele cristale de smalț formate cresc printre cristalele de dentină. În stadiul secretor, smalțul este bogat în proteine și are o consistență moale asemănătoare brânzei. Ameloblastele secretă cantități mari de proteine ale matricei smalțului pe măsurăce se departează de suprafața dentinei. În asociere cu proteinele nou secretate, se formează rapidbenzi minerale lungi și subțiri.Benzile de cristalite paralele, aproximativ 10-40000 [5], vor forma în cele din urmă o prismăși fiecare ameloblast este responsabil pentru crearea unei prisme de smalț. Cristalitele minerale care se dezvoltăîntre prisme (interprismatice) pot avea lungimi limitate, dar ele sunt intotdeauna poziționate spațial în unghi față de cristalitele prismatice[4]. În timpul stadiului secretor ameloblastele secretă trei proteine structurale(amelogenina, ameloblastinași enamelina) și o proteinază (matrix metalloproteinase-20, MMP20, Enamelysin).Amelogenina reprezintă aproximativ 80-90% din materia organicăși ameloblastinași enamelinareprezintă 5% și, respectiv, 3-5% [6]. MMP20 este prezentăîntr-o cantitate foarte mică (”trace amounts”). Cristalele de smalț se vor forma în absența amelogeninei dar nu se vor forma dacăameloblastinasau enamelina sunt absente.Până la finalul stadiului secretor stratul de smalța ajuns la întreaga grosime și la 30% din conținutul de minerale. Stadiul de tranziție:  Ameloblasteleacoperăsuprafața smalțului cu unstrat finalde smalț aprismatic. Stadiul de maturare: Ameloblastele secretăîn mod activ kallikrein-related peptidase-4 (KLK4) pentru aajuta la îndepărtarea masei de proteine a matricei care anterior au fost secretate și parțial hidrolizate, astfel încât cristalitele prismatice și interprismatice își pot mări volumul. Benzile inițiale de smalțconțin doar puține cristale de apatită [Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂] care nu se întind pe întreaga grosime a stratului de smalț[7]. Dupăce prismele de smalț s-au format, există o zonăîntre smalțul prismatic și cel interprismatic care conțineo matrice organică subțire fără cristale, numităteaca prismei[8] (Figs 1-2).

MMP20 și KLK4

S-a arătat că MMP20 (Enamelysin) este secretată de către ameloblaste în stadiul secretor. Este singura proteinază prezentăîn matricea smalțului în timpul stadiului secretor[9,10].

Funcția principală a MMP20 este de adescompuneproteina cea mai abundentăîn matricea smalțului, amelogenina[10]. Este posibil de asemenea ca ea să fie responsabilă de generarea unui produs de descompunere al enamelinei. De asemenea, MMP20 va descompune propeptida KLK4 pentru a produce KLK4 activă catalitic [11]. MMP20 umanăeste controlată deo genă de pe cromozomul11q22-q23.Sunt cunoscute șapte mutații diferite ale MMP20 umane care determină AmelogenezăImperfectă (AI) forma hipomaturată sau hipoplazică-hipomaturată de cauză autozomal recesivă.Dinții au dimensiune normală dar stratul de smalț nu are un contrast bun față de dentină pe radiografie și smalțul are tendința să se desprindă[12,13].Absența MMP20 funcționale la speciile de mamifere fără smalț (balene) a demonstrat căMMP20este esențială pentru formarea smalțului, dar nu este esențială pentru orice altă funcție biologică. KLK4face parte dintr-o familie de 15 serin-proteaze, gena sa fiindlocalizatălângă telomer pe brațul lung al cromozomului 19.KLK4 se secretă la începutul stadiului de maturare, când proteinele smalțului sunt reabsorbite din smalțul în curs de întărire[14].Singura funcție esentială a KLK4 esteîn formarea smalțului.KLK4 este activată de către MMP20 și de către o cistein aminopeptidază[15]. KLK4este necesar pentru aclivaagregateleproduselor de descompunere a proteinelor acumulate în regiunile profunde ale stratului de smalț.Sunt cunoscute doua mutații diferite ale KLK4 la om care determină AI forma hipomaturată autozomal recesivă. Smalțul are grosime normală dar se desprinde de pe dentină.KLK4 este esențială pentru ca smalțul să ajungă la duritatea sa finală, singura sa funcție, la fel ca MMP20, fiind în formarea smalțului dentar.

MIH

Hipomineralizarea Molar – Incisiv (Molar Incisor Hypomineralization – MIH), un defect de hipomineralizare a smalțului, afectează unul sau mai mulți molari unu permanenți cu sau fără afectarea incisivilor permanenți [16].MIH survine când ameloblastele sunt afectate în stadiul de maturareși ca rezultat smalțul este mineralizat mai puțin de 96%. Clinic, prezintă severitate asimetrică cu opacități demarcate a căror culoare variază de la alb la galben-brun, cu o demarcație netăîntre smalțul afectat și cel sănătos[17]. Caracteristica principală a dinților cu MIH este smalțul poros care poate fi ușor deteriorat datorită forțelor masticatorii (Fig 3). Copiii cu MIH pot să prezinte sensibilitate dentara mai intensă datorită variațiilor de temperatură, datorită combinației între pulpita cronicăși inervația regiunii de sub zona hipomineralizată[18]. Nu există date clareîn legatură cu etiologia MIH. O cercetare genetică a populațiilor afectate de MIH din Turciași Braziliaa aratat că marker-ulENAMrs 3796704 a fost asociat cu manifestarea MIH [19].

Conținutul mineral al smalțului molarului hipomineralizateste foarte scăzut. În smalțul normal, calciul este 46,3% și fosfatul 36,5%, iar în molarul afectat calciul reprezintă 30,99% și fosfatul 14,53% [20] (Fig 4 și Tabelul 1). Conținutul în proteine al molarilor afectați de MIH:comparativ cu smalțul sănătos, smalțul maro prezintăun conținut de proteine de 15–21 ori mai mareși smalțul gălbui șicel alb cretos prezintă un conținut de proteine de aproape 8 ori mai mare [21].Studiile morfologice inițiale folosind microscop cu lumină polarizată au demonstrat că există zone de porozitate de grade diferite.

Tabelul 1: Conținutul mineral (%) al molarului cu MIH

Analize microstructurale recente folosind microscopie electronică cu scanare (scanning electron microscopy – SEM) au identificat o structura prismatică mai puțin bine organizată care prezintă goluri, comparativ cu smalțul sănătos a cărui structură prismatică este bine organizată[22]. Analizele la microscopul electronic cu transmisie au arătat că zonele hipomineralizate ale smalțului au fost asociate cu schimbări marcate în microstructură: cristale de apatită cu legături slabe între ele în interiorul prismelorșiregiuni mai largi de teacă. Aceste modificări microstructurale par să se producă în timpul maturării smalțului[23].

Bazându-ne pe datele publicate despre dinții cu MIH, precum reducerea conținutului mineral al smalțului, concentrația mai mare de proteine (de 8-20 ori mai mare) și regiuni mai largi de teacă, putem să considerăm că principala problemă la dinții cu MIH este degradarea redusă a proteinelor. Dupa stadiul secretor al amelogenezei conținutul mineral este de 30%, în timp ce după stadiul de maturare conținutul mineral ajunge la 85%. Astfel, pare că MIH se produce în timpul stadiului de maturare, când KLK4 este proteinaza principală care degradează conținutul proteic al smalțului și permite astfel cristalelor de apatită să crească în volum.

Prevalența MIH raportată pe glob a fost între 2,9-44% [24]. În Israel, prevalența MIH într-o populație arabăa fost semnificativ mai mare la băieții în vârstă de 6-10 ani față de fetele de aceeași vârstă, 19,8% față de 16,6% (P<0,05) [25]. Analiza MMP20 și KLK4 a fost realizată la un lot de 500 copii cu vârste între 0 și 5 ani într-o populație arabă din Israel, aceeași populatie la care s-a analizat prevalența MIH [26]. Concentrația MMP20 la băieți a fost semnificativ mai scăzută (P<0,05) în comparație cu fetele și rezultatele pentru KLK4 au fost similare. Când s-au comparat grupele de vârstă, vârsta mai mică de 2 ani și grupa de vârstă 2-5 ani, concentrația KLK4 a fost semnificativ mai mare la grupa de vârstă mai mică. Vârsta de 2 ani este semnficativă deoarece MIH afectează doar 2/3 din coroana primilor molari permanenți, parte a coroanei care se formeazăși se mineralizează în primii doi ani după naștere. Diferențe semnificative în concentrația MMP20 între băieți și fete pot fi legate de diferențele privind prevalența MIH între băieți și fete. Concentrația mică de MMP20 la băieți poate explica prevalența mai crescută a MIH la băieți în populația arabă din Israel.

Pasul următor este să se examineze clinic după 2-3 ani copiii la care s-a analizat concentrația MMP20 și KLK4 pentru a permite erupția molarilor șisă se încerce să se facă niște corelații între observațiile clinice asupra MIH și concentrațiile proteinazelor.

Concluzii

• Amelogeneza începe prin crearea unei matrici proteice de către ameloblaste care se mineralizează pe măsurace ameloblastele de deplasează în sens centrifug.
• Proteinele din smalț sunt specializate și pot fi detectate doar în smalț în timpul amelogenezei.
• Proteazele care degradează proteinele smalțului sunt MMP20 și KLK4.
• În MIH conținutul mineral al smalțului este redus și conținutul în proteine este foarte mare.
• Se poate afirma căMIH este cauzat de afectarea funcțiilor proteazelor smalțului.
• Cercetările ar trebui să pună accent pe genele care reglează proteazele.

Bibliografie

1. Chai H, Lee JJW, Constantino PJ et al. Remarkable resilience of teeth. Proc Nat1 AcadSci USA 2009;106: 7289-93.
2. Slavkin H. Developmental Craniofacial Biology, Lea and Febiger, Philadelphia, Pa, USA, 1979.
3. Mjor IA, Ole F. Human Oral Embriology and Histology, Munksgaard, Copenhagen, Denmark, 1986.
4. Nanci A. Ten Cate’s Oral Histology, Development, Structure and Function, Mosby, St. Louis, Mo, USA, 2003.
5. Daculsi G, Menanteau J, Kerebel LM, Mitre D. Length and shape of enamel crystals. Calified Tissue Int 1984, 36;5: 550-5.
6. Deakins M, Volker JF. Amount of organic matter in enamel from several types of human teeth. J Dent Res 1941, 20; 2: 117-21.
7. Daculsi G, Kerebel B. High-resolution electron microscope study of human enamel crystallites: size, shape and growth. J Ultrastructure Res 1978, 65; 2: 163-72.
8. Travis DF, Glimcher MJ. The structure and organization of, and the relationship between organic matrix and the inorganic crystals of embryonic bovine enamel. J Cell Biol 1964, 23: 447-97.
9. Hu JC, Sun X, Zhang C et al. Enamelysin and kallikrein-4 mRNA expression in the developing mouse molars. Eur Oral Sci 2002, 110: 307-15.
10. Nagano T, Kakegawa A, Yamakoshi Y et al. MMP-20 and KlK-4 cleavage site preference for amelogenin sequences. J Dent Res 2009, 88; 9: 823-8.
11. Ryu O, Hu JCC, Yamakoshi Y et al. Porcine kallikrein-4 activation, glycosylation, activity and expression in prokaryotic and eukaryotic hosts. Eur J Oral Sci 2002, 110; 5: 358-65.
12. Kim JW, Simmer JP, Hart TC et al. MMP20 mutation in autosomal recessive pigmented hypomaturation amelogenesis Imperfecta. J Med Genet 2005, 42; 3: 271-5.
13. Papagerakis P, Lin HK, Lee KY et al. Premature stop codon in MMP20 causing amelogenesis imperfecta. J Dent Res 2008, 87; 1: 56-9.
14. Overall CM, Limeback H. Identification and characterization of enamel proteinases isolated from developing enamel. Amelogeninolytic serine proteinases are associated with enamel maturation in pig. Biochemical J 1988, 256; 3: 965-72.
15. Tye CE, Pham CT, Simmer JP, Bartlett JD. DPPI may activate KLK4 during enamel formation. J Dent Res 2009, 88; 4: 323-7.
16. Weerheijm KL. Molar incisor hypomineralization (MIH). Eur J Paediatr Dent 2003, 4(3): 115-20.
17. Weerheijm KL, Duggal M, Mejare I et al. Judgement criteria for molar incisor hypomineralization (MIH) in epidemiologic studies: a summary of the European meeting on MIH held in Athens. Eur J Paediatr Dent 2003, 4 (3): 110-3.
18.  Rodd HD, Morgan CR, Boissonade FM. Pulpar expression of TRPV1 in molar incisor hypomineralization. Eur J Paediatr Dent 2007, 8(4): 184-8.
19. Jeremias F, Koruyuku M, Kuchler EC et al. Genes expressed in dental development are associated with molar-incisor hypomineralization. Arch Oral Biol 2013; 58(10): 1434-42.
20. Zilberman U, Hassan J, Leibovitz S. Molar incisor hypomineralization and pre-eruptive intracoronal lesion in dentistry – diagnosis and treatment planning. World J Stomatol 2019, 7(2): 20-7.
21. Farah MA, Monk BC, Swain MB, Drummond BK. Protein content of molar-incisor hypomineralization enamel. J Dent 2010, 38: 591-596.
22. Jalevik B, Dietz W, Noren JG. Scanning electron micrograpf analysis of hypomineralized enamel in permanent first molars. Int J Paediatr Dent 2005, 15: 233-40.
23. Xie Z, Kilpatrick NM, Swain MV et al. Transmission electron microscope characterization of molar-incisor-hypomineralization. J Mater Sci: Mater Med 2008, 19: 3187-92.
24. Elfrink ME, Ghanim A, Manton DJ et al. Standardized studies on Molar Incisor Hypomineralization (MIH) and Hypomineralized Second Primary Molars (HSPM): a need. Eur Arch Paediatr Dent 2015, 16: 247-55.
25. Hassan J, Leibovitz S, Cohen O, Zilberman U. The prevalence of Molar-Incisor-Hypomineralization among children in Jewish and Arab population in Israel.
26. Hassan J, Mansour B, Hanut A, Cohen O, Zilberman U. Examination of enzymatic concentration of MMP20 and KLK4 in serum and saliva of children ages 0-5 years. Sci Arch Dent Sciences 2020; 3(8): 12-7.